| 下載文件詳細(xì)資料 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 文件名稱： | SKD-200定氮儀的實(shí)驗(yàn)報(bào)告 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 公司名稱： | 上海沛歐分析儀器有限公司 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 下載次數(shù)： | 4026 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 文件詳細(xì)說明： | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>：驗(yàn)證沛歐SKD-200型凱氏定氮儀對(duì)低蛋白量樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確度與精確度 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)人：沙金 實(shí)驗(yàn)執(zhí)行人：沙金 實(shí)驗(yàn)時(shí)期：2010-3-11
儀器與試劑： 凱氏定氮儀（SKD-200，上海沛歐分析儀器有限公司） 精密分析天平（FA2004，上海精科天平廠） 通風(fēng)櫥 水槽 500mL三角瓶若干 25mL酸式滴定管 50mL量筒 1mL移液器與槍頭 10mL離心管 藥匙 稱量紙
固體硫酸鉀/硫酸銅催化劑=3:1（w/w） 樣品1：0.5mg/mL BSA 2mL（containing 50% glycerol） 樣品2：0.5 mg/mL 大豆浸提液 2mL (containing 50% glycerol） 樣品3：標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨 (1mg N/mL) 空白對(duì)照：saline (containing 50% glycerol） 濃硫酸(AR) 35% NaOH 2% H3BO3 混合指示劑：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液:0.1%甲基的紅乙醇溶液=5:1 0.1N NaOH 0.1N HCl 0.01037N 滴定用HCl
操作步驟： 1. 消化： 將預(yù)先稱量好的固體硫酸鉀/硫酸銅催化劑粉末約6g（可適當(dāng)加量）小心加入洗凈干燥的消化管底部；分別將樣品1、2和空白對(duì)照（約2mL）各兩份用分析天平差減法直接倒入消化管底部，記錄各組重量；用量筒小心稱取濃硫酸16mL加入各消化管底部。將消化管放在管架上，放入消化爐，啟動(dòng)通風(fēng)櫥。設(shè)置消化溫度時(shí)間曲線：170℃（根據(jù)樣品碳化和沸騰的情況，可適當(dāng)提高或降低預(yù)消化溫度，并盡量避免樣品碳化沸騰掛壁以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度），30min——250℃，10min——370℃（為保證消化效果，可根據(jù)情況適當(dāng)提高至400℃以上），120min。當(dāng)消化管內(nèi)出現(xiàn)穩(wěn)定的恒沸白色酸霧并回流時(shí)，可蓋上消化管蓋以減少硫酸損失。當(dāng)樣品被消化為明亮的藍(lán)綠色或綠色液體時(shí)，即可停止消化，待其冷卻至室溫后，取出蒸餾，關(guān)閉通風(fēng)櫥。
2. 蒸餾： 向凱氏定氮儀的三個(gè)儲(chǔ)液桶中分別加入足量的35%NaOH、2%H3BO3和蒸餾水（根據(jù)處理樣品量，至少1L），旋緊儲(chǔ)液桶蓋子。開機(jī)，打開循環(huán)水，不放入樣品，預(yù)蒸餾2min。向樣品管中小心加入20mL蒸餾水以稀釋硫酸，待其變?yōu)槊髁恋乃{(lán)色溶液時(shí)，小心放入蒸餾架，卡緊卡槽時(shí)注意將消化樣品管口卡緊以防止氨蒸氣流失；向500mL接收三角瓶中加入少量（約0.6mL）混合指示劑，并設(shè)定加硼酸12s，加堿8s，蒸餾8—9min，保存設(shè)置后啟動(dòng)儀器。當(dāng)氨蒸氣隨冷凝水流出時(shí)（注意氨蒸氣管出口浸沒于接收三角瓶的硼酸溶液中），接收瓶中的硼酸溶液會(huì)由玫紅色變?yōu)樗{(lán)色，待蒸餾完畢，用蒸餾水將氨蒸氣管出口的殘液沖洗入接收瓶后取出待測(cè)。將樣品管取出，小心倒入水槽，并及時(shí)清洗。放入下一個(gè)樣品管和接收瓶，重復(fù)以上操作。蒸餾完畢后，關(guān)閉循環(huán)水。待蒸餾水冷卻后放出。如短時(shí)間內(nèi)不再使用定氮儀，應(yīng)用蒸餾水替換酸液和堿液，重復(fù)加酸加堿過程以清洗酸堿管路，維護(hù)設(shè)備。
3. 滴定 用0.1N NaOH、0.1NHCl、蒸餾水分別潤(rùn)洗酸式滴定管各三次，最后用0.01037N滴定用標(biāo)準(zhǔn)HCl潤(rùn)洗兩三次。加入0.01037N滴定用標(biāo)準(zhǔn)HCl，并小心放液至0刻度。開始滴定，左手控制滴定速度，右手不斷搖動(dòng)混勻三角瓶中溶液。（可預(yù)先對(duì)樣品消耗鹽酸量有一個(gè)大致的估計(jì)，即每毫升0.01N鹽酸可滴定約0.14mg氮）臨近滴定終點(diǎn)時(shí)溶液開始由藍(lán)色變?yōu)樗{(lán)灰色，在最后一滴或半滴時(shí)微微呈現(xiàn)紫紅色。視線與滴定管水平時(shí)讀取并記錄鹽酸消耗量。用0.01037N滴定用標(biāo)準(zhǔn)HCl補(bǔ)滿至0刻度后，可滴定下一個(gè)樣品。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1. 各組樣品取樣量：
注：甘油密度1.2613g/mL，生理鹽水密度1.00 g/mL，則樣品溶液密度1.1307g/mL 蛋白取樣量（mg）= 取樣量（g）/ 樣品溶液密度 X 0.5 mg/mL
2. 各組樣品消耗鹽酸量：
注：每消耗1mL0.01N的鹽酸相當(dāng)于0.14mg氮；動(dòng)物膠K=5.6（N=18.0%），大豆制品K=6.0（16.7%）。
討論： 從檢測(cè)結(jié)果看，當(dāng)測(cè)量氮含量為0.18mg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在±3%以內(nèi)，而空白對(duì)照的含氮量進(jìn)一步下降為0.03mg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)偏差仍控制在±10%以內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較為理想。但兩組實(shí)驗(yàn)測(cè)量值均大于真值，分析原因：1）BSA組高15.4%，懷疑實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所距動(dòng)物房較近，造成結(jié)果偏高。2）大豆浸提液組高44.7%，懷疑不僅有1）的原因，而且浸提液中含有較高的非蛋白氮干擾，建議將浸提蛋白沉淀后再以凱氏定氮法測(cè)量。
另：以標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨檢測(cè)的蒸餾回收效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)?shù)繛?span>1mg 時(shí)，以1500W蒸餾器蒸餾8min，平均氮回收率為96.9%；以1500W蒸餾器蒸餾9min，平均氮回收率可達(dá)100%，蒸餾回收效果理想。建議對(duì)于低蛋白含量樣品測(cè)量而言，降低蒸餾器功率，并適當(dāng)延長(zhǎng)蒸餾時(shí)間可進(jìn)一步改善回收率，從而使結(jié)果重復(fù)性更好
注：作者系上海我武生物公司研發(fā)部生化博士
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